Citofluorimetria

• DESCRIZIONE
• ATTIVITÀ

• Il servizio consente di: 1) ottenere popolazioni cellulari altamente purificate, provenienti da vari tipi di tessuti umani ed animali tramite cell sorting ad alta processività; 2) caratterizzare fenotipicamente le popolazioni isolate e/o eventuali popolazioni cellulari circolanti nel sangue periferico umano o di animali da laboratorio; 3) monitorare la proliferazione, sopravvivenza e differenziamento cellulare in seguito a trattamenti farmacologici in vitro e/o in vivo. Il servizio di citofluorimetria e cell sorting collabora con i servizi di biobanca e microscopia nella caratterizzazione delle cellule di interesse.

  

  Analisi immunofenotipica avanzata di cellule T della memoria CD8+ CD45RA-

  

  Valutazione dell’apoptosi cellulare con AnnessinaV-FITC/PI

• • Studio del livello di ploidia mediante colorazione con ioduro di propidio e valutazione delle fasi del ciclo cellulare in analisi monoparametrica.
  • Proliferazione cellulare: valutazione quantitativa delle varie fasi del ciclo cellulare (G0/G1, S, G2/M) mediante incorporazione di BrdU e sua rilevazione tramite doppia marcatura con anticorpo anti-BrdU/PI.
  • Valutazione quantitativa dell’apoptosi cellulare mediante AnnexinV/PI o 7AAD.

  

  Valutazione del ciclo cellulare con BrdU-FITC/PI

  • Caratterizzazione di sottopopolazioni cellulari circolanti nel sangue periferico umano o di animali da laboratorio: individuazione di sottopopolazioni linfocitarie, di monociti e granulociti mediante i parametri fisici (forward scatter e side scatter) e loro caratterizzazione immunofenotipica tramite analisi mono/multiparametrica.

  

  Analisi immunofenotipica di BAL di topo

  • Monitoraggio dell'efficienza di transfezioni che prevedano l’utilizzo di molecole fluorescenti (GFP), e possibilità di sorting delle cellule GFP positive.
  • Monitoraggio del differenziamento cellulare mediante l’analisi di marcatori lineage specifici di membrana.
  • Caratterizzazione fenotipica di popolazioni cellulari di interesse, in analisi multiparametrica con la possibilità di utilizzare fino a 9 fluorocromi diversi, e loro successiva separazione fisica in condizioni vitali.

  

  Valutazione dell'espressione di citochine intracitoplasmatiche in cellule T della memoria

  • Isolamento di popolazioni cellulari vitali altamente purificate (identificate da marcatori specifici di membrana) da vari tipi di tessuti umani ed animali, tramite cell sorting ad alta processività.

  

  Valutazione della attività mitocondriale con MitotrackerRed CMXROs

  L’area d’interesse di queste applicazioni riguarda sia la valutazione in vitro degli effetti di farmaci, citochine o composti di varia natura, sia la ricerca volta all’approfondimento clinico di varie patologie.

  

  Saggio della degranulazione con espressione della molecola CD107a per valutare l’attività delle cellule immunitarie citotossiche

• Cell Sorter BD FACSAria IIIu
• BD FACSCalibur Analyzer 4 colori

• 

  Cell Sorter BD FACSAria IIIu

  Citometro e cell-sorter ad alte prestazioni, dotato di 4 sorgenti laser (488nm - blu, 633nm - rosso, 405nm - violetto, 375nm - near UV); permette di analizzare contemporaneamente fino a 13 parametri, di cui 11 di fluorescenza.

  Il numero di laser installati, in associazione al rivoluzionario banco ottico, consentono un notevole ampliamento del numero di fluorescenze che lo strumento può analizzare simultaneamente e conseguentemente della scelta dei fluorocromi utilizzabili.

  Le superiori prestazioni del sistema di eccitazione e di raccolta delle fluorescenze, dell’elettronica e del software FACSDiva 9, coadiuvate dalla semplicità d’uso dello strumento e dalla rapidità di settaggio strumentale, dovuta all’introduzione della tecnologia di allineamento fisso, che garantisce anche un’elevatissima riproducibilità, rendono il FACSAria IIIu il cell sorter d’elezione nel moderno laboratorio di ricerca biomedica.

  La nostra facility si avvale del software FlowJo per l’analisi dei dati. Questo potente software di analisi citofluorimetrica permette l’analisi di dati provenienti da qualsiasi citofluorimetro, rendendo il processo di analisi delle acquisizioni multiparametriche più efficiente, facile e veloce.

  BD FACSAria IIIu specifiche

  • Cell sorter ad alta processività, con cuvetta di tipo quadrato ad alta sensibilità
  • 4 lasers con lunghezze d’onda nearUV (375nm), violet (405nm), blue (488nm) and red (633nm)
  • Acquisizione digitale fino a 70000 eventi/sec
  • Velocità di sorting fino a 20000 eventi/sec
  • Analisi multiparametrica fino a 12 parameteri
  • Nozzle da 70μm, 85μm, 100μm and 130μm
  • Possibilità di sorting a 4 vie in eppendorf da 1.5ml o tubi da 4ml
  • Single cell sorting in piastre da 6-, 24-, 96- and 384- pozzetti o in vetrini per miscroscopia

  Lasers (exitation)	PMTs	BP Filters (emission)	Fluorochromes (examples)
  *Note: nearUV and Violet lasers cannot be used at the same time.
  Blue 488 nm	A FL1	780/80	PE-Cy7, PE-Vio770, Qdot800
  	B FL2	698/40	PerCP, PerCP-Cy5.5, PerCP-Vio700, PerCP-eFluor710, 7-AAD, PI
  	C FL3	616/23	PE-TexasRed
  	D FL4	585/42	PE
  	E FL5	530/30	FITC, Alexa 488, GFP, Sytox Green, CFSE, DCFDA
  	F SSC	488/10	SSC
  Red 633 nm	A FL6	780/60	APC-H7, APC-Vio770, Live/DEAD Near-IR
  	B FL7	730/45	AF700
  	C FL8	660/20	APC
  Violet 405 nm*	A FL9	780/60	BV750, BV785
  	B FL10	530/30	V500, VioBlue, AmCyan, BV510, Pacific Orange, LIVE/DEAD Aqua
  	C FL11	450/40	V450, VioBlue, Pacific Blue, CellTracker Violet, Zombie violet, AF405
  Near UV 375 nm*	A FL9	780/60	BUV737, BUV805
  	B FL10	530/30	Indo-1 (Blue)
  	C FL11	450/40	Hoechst Blue, DAPI

• 

  Citofluorimetro BD FACSCalibur

  Citometro a flusso da banco dotato di due sorgenti luminose spazialmente separate: un laser argon, raffreddato ad aria, con emissione a 488 nm ed un laser rosso a diodo (Visible Red Diode Laser) con emissione a 635 nm. La configurazione ottica permette di analizzare fino a 6 parametri di cui 4 di fluorescenza, consentendo la massima flessibilità nella scelta dei fluorocromi.

  Ideato specificatamente per supportare un ampio range di applicazioni, il FACSCalibur è caratterizzato da un elevato livello di automazione (controllo strumentale gestito via software, controllo digitale della fluidica) per garantire l’estrema riproducibilità dei risultati ottenuti.

  La nostra facility si avvale del software FlowJo per l’analisi dei dati. Questo potente software di analisi citfluorimetrica permette l’analisi di dati provenienti da qualsiasi citofluorimetrio e permette l’esecuzione di analisi complesse, rendendo più efficiente, facile e veloce il processo di analisi delle acquisizioni multiparametriche.

  Lasers (exitation)	PMTs	BP Filters (emission)	Fluorochromes (examples)
  Blue 488 nm	A FL1	530/30	FITC, Alexa 488, GFP, Sytox Green, CFSE, DCFDA
  	B FL2	585/42	PE
  	C FL3	670 LP	PerCP, PerCP-Cy5.5, PerCP-Vio700, PerCP-eFluor710, 7-AAD, PI
  Red 633 nm	D FL4	661/16	APC

Indirizzo

Servizio di Citofluorimetria e Cell Sorting
Area Polo Chimico Biomedico ‘CUBO’ – piano terzo
Via Fossato di Mortara 70 - 44121 Ferrara
+39 0532 455936/718/849
+39 0532 455718

Direttore Tecnico

Prof. Elisabetta Melloni
elisabetta.melloni@unife.it
+39 0532 455936

Referente

Dott. Fabio Casciano
fabio.casciano@unife.it
+39 0532 455718

Staff

Dr Fabio Casciano
Dr Elisabetta Melloni

Lo staff si occupa i) dell’accettazione e dell’eventuale processazione/staining dei campioni, ii) della caratterizzazione e/o isolamento delle cellule di interesse, iii) dell’analisi dei risultati, iv) del loro controllo di qualità.

Casciano F, Diani M, Altomare A, Granucci F, Secchiero P, Banfi G, Reali E (2020). CCR4+ Skin-Tropic Phenotype as a Feature of Central Memory CD8+ T Cells in Healthy Subjects and Psoriasis Patients. Front Immunol; 11:529. doi: 10.3389/fimmu.2020.00529. PubMed

Diani M, Casciano F, Marongiu L, Longhi M, Altomare A, Pigatto PD, Secchiero P, Gambari R, Banfi G, Manfredi AA, Altomare G, Granucci F, Reali E (2019). Increased frequency of activated CD8+ T cell effectors in patients with psoriatic arthritis. Sci Rep; 9(1):10870. doi: 10.1038/s41598-019-47310-5. doi: 10.1038/s41598-019-47310-5. PubMed

Chiriaco M, Casciano F, Di Matteo G, Gentner B, Claps A, Di Cesare S, Cotugno N, D'Argenio P, Rossi P, Aiuti A, Finocchi A (2018). Impaired X-CGD T cell compartment is gp91phox-NADPH oxidase independent. Clin Immunol; 193:52-59. doi: 10.1016/j.clim.2018.01.010. PubMed

D'Abundo L, Callegari E, Bresin A, Chillemi A, Elamin BK, Guerriero P, Huang X, Saccenti E, Hussein E, Casciano F, Secchiero P, Zauli G, Calin GA, Russo G, Lee LJ, Croce CM, Marcucci G, Sabbioni S, Malavasi F, Negrini M (2017). Anti-leukemic activity of microRNA-26a in a chronic lymphocytic leukemia mouse model. Oncogene; 36(47):6617-6626. doi: 10.1038/onc.2017.269. PubMed

Secchiero P, Voltan R, Rimondi E, Melloni E, Athanasakis E, Tisato V, Gallo S, Rigolin GM, Zauli G (2017). The γ-secretase inhibitors enhance the anti-leukemic activity of Ibrutinib in B-CLL cells. Oncotarget; 8(35):59235-59245. doi:10.18632/oncotarget.19494. PubMed

Feriotto G, Calza R, Bergamini CM, Griffin M, Wang Z, Beninati S, Ferretti V, Marzola E, Guerrini R, Pagnoni A, Cavazzini A, Casciano F, Mischiati C (2016). Involvement of cell surface TG2 in the aggregation of K562 cells triggered by gluten. Amino Acids 49(3):551-565. doi: 10.1007/s00726-016-2339-4. PubMed

Voltan R, Rimondi E, Melloni E, Gilli P, Bertolasi V, Casciano F, Rigolin GM, Zauli G, Secchiero P (2016). Metformin combined with sodium dichloroacetate promotes B leukemic cell death by suppressing anti-apoptotic protein Mcl-1. Oncotarget 7(14):18965-77. doi: 10.18632/oncotarget.7879. PubMed

Trapella C, Voltan R, Melloni E, Tisato V, Celeghini C, Bianco S, Fantinati A, Salvadori S, Guerrini R, Secchiero P, Zauli G (2016). Design, Synthesis, and Biological Characterization of Novel Mitochondria Targeted Dichloroacetate-Loaded Compounds with Antileukemic Activity. J Med Chem. 59(1):147-56. doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01165. PubMed

Agnoletto C, Melloni E, Casciano F, Rigolin GM, Rimondi E, Celeghini C, Brunelli L, Cuneo A, Secchiero P, Zauli G (2014). Sodium dichloroacetate exhibits anti-leukemic activity in B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and synergizes with the p53 activator Nutlin-3. Oncotarget 5:4347-60. doi:10.18632/oncotarget.2018. PubMed

Athanasakis E, Melloni E, Gian Matteo Rigolin GM, Agnoletto C, Voltan R, Vozzi D, Piscianz E, Segat L, Dal Monego S, Cuneo A, Secchiero P, Zauli G (2014). The p53 transcriptional pathway is preserved in ATMmutated and NOTCH1mutated chronic lymphocytic leukemias. Oncotarget; 5(24):12635-45. doi:10.18632/oncotarget.2211. PubMed

• Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara
• Centro di Riferimento Oncologico (CRO) di Aviano
• IRCCS Burlo Garofolo di Trieste
• Azienda Ospedaliera di Cremona
• Azienda Ospedaliera di Udine

Alcune prestazioni/prodotti offerti possono usufruire della collaborazione/integrazione con altri servizi del Laboratorio LTTA.
Ciascun servizio include la fornitura di immagini e/o di files ai fini di eventuali pubblicazioni scientifiche.
I prezzi sono da intendere senza IVA e soggetti ad aggiornamento in base alle tariffe dei prodotti di consumo necessari per la prestazione (ogni 12 mesi).