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Laboratorio di Ricerca Industriale e Trasferimento Tecnologico accreditato dalla Regione Emilia Romagna (DGR 1213/2007) con Delibera n.GPG/2012/119 del 6 febbraio 2012.

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Citofluorimetria

  • Competenze e Tecnologie

    Il gruppo di ricerca responsabile del servizio di Citofluorimetria e Cell Sorting ha acquisito negli anni elevate competenze nel campo della ricerca bio-medica. In particolare il gruppo ha esperienza (certificata da numerose pubblicazioni su riviste scientifiche internazionali) di citofluorimetria affiancata a tecniche di biologia molecolare e biologia cellulare applicate nell'ambito di progetti di ricerca riguardanti principalemente la fisiopatologia vascolare, le cellule staminali e l'onco-ematologia.

    Le tecnologie a disposizione del servizio di Citofluorimetria e Cell Sorting sono all'avanguardia sul mercato e consentono innumerevoli applicazioni in svariati ambiti di ricerca. In particolare tra le strumentazioni, come dettagliato nell’apposita sezione, spicca per potenza e versatilità il cell sorter BD FACSAria IIIu, che è presente in pochi centri italiani.

    Esempi applicativi per i quali il servizio di Citofluorimetria e Cell Sorting può fornire supporto sono:

    1. Applicazioni per la ricerca di base/ preclinica in particolare per la valutazione in vitro degli effetti di farmaci, citochine o composti di varia natura su cellule di diversa origine.
    2. Studi mirati nell’ambito della ricerca clinica.
    3. Sviluppo/miglioramento di prodotti industriali che prevedano l'uso di tecniche citofluorimetriche.
    4. Ideazione di protocolli innovativi di terapia cellulare in modelli preclinici.
    • Il servizio consente di: 1) ottenere popolazioni cellulari altamente purificate, provenienti da vari tipi di tessuti umani ed animali tramite cell sorting ad alta processività; 2) caratterizzare fenotipicamente le popolazioni isolate e/o eventuali popolazioni cellulari circolanti nel sangue periferico umano o di animali da laboratorio; 3) monitorare la proliferazione, sopravvivenza e differenziamento cellulare in seguito a trattamenti farmacologici in vitro e/o in vivo. Il servizio di citofluorimetria e cell sorting collabora con i servizi di biobanca e microscopia nella caratterizzazione delle cellule di interesse.

      • Studio del livello di ploidia mediante colorazione con ioduro di propidio e valutazione delle fasi del ciclo cellulare in analisi monoparametrica.
      • Proliferazione cellulare: valutazione quantitativa delle varie fasi del ciclo cellulare (G0/G1, S, G2/M) mediante incorporazione di BrdU e sua rilevazione tramite doppia marcatura con anticorpo anti-BrdU/PI.
      • Valutazione quantitativa dell’apoptosi cellulare mediante AnnexinV/PI o 7AAD.
      • Caratterizzazione di sottopopolazioni cellulari circolanti nel sangue periferico umano o di animali da laboratorio: individuazione di sottopopolazioni linfocitarie, di monociti e granulociti mediante i parametri fisici (forward scatter e side scatter) e loro caratterizzazione immunofenotipica tramite analisi mono/multiparametrica.
      • Monitoraggio dell'efficienza di transfezioni che prevedano l’utilizzo di molecole fluorescenti (GFP), e possibilità di sorting delle cellule GFP positive.
      • Monitoraggio del differenziamento cellulare mediante l’analisi di marcatori lineage specifici di membrana.
      • Caratterizzazione fenotipica di popolazioni cellulari di interesse, in analisi multiparametrica con la possibilità di utilizzare fino a 9 fluorocromi diversi, e loro successiva separazione fisica in condizioni vitali.
      • Isolamento di popolazioni cellulari vitali altamente purificate (identificate da marcatori specifici di membrana) da vari tipi di tessuti umani ed animali, tramite cell sorting ad alta processività.

      L’area d’interesse di queste applicazioni riguarda sia la valutazione in vitro degli effetti di farmaci, citochine o composti di varia natura, sia la ricerca volta all’approfondimento clinico di varie patologie.

  • Strumentazioni rilevanti

    • Citometro e cell-sorter ad alte prestazioni, dotato di 4 sorgenti laser (488nm - blu, 633nm - rosso, 405nm - violetto, 375nm - near UV); permette di analizzare contemporaneamente fino a 12 parametri, di cui 10 di fluorescenza.

      Il numero di laser installati, in associazione al rivoluzionario banco ottico, consentono un notevole ampliamento del numero di fluorescenze che lo strumento può analizzare simultaneamente e conseguentemente della scelta dei fluorocromi utilizzabili.

      Le superiori prestazioni del sistema di eccitazione e di raccolta delle fluorescenze, dell’elettronica e del software FACSDiva 9, coadiuvate dalla semplicità d’uso dello strumento e dalla rapidità di settaggio strumentale, dovuta all’introduzione della tecnologia di allineamento fisso, che garantisce anche un’elevatissima riproducibilità, rendono il FACSAria IIIu il cell sorter d’elezione nel moderno laboratorio di ricerca biomedica.

      La nostra facility si avvale del software FlowJo per l’analisi dei dati. Questo potente software di analisi citofluorimetrica permette l’analisi di dati provenienti da qualsiasi citofluorimetro, rendendo il processo di analisi delle acquisizioni multiparametriche più efficiente, facile e veloce.

      BD FACSAria IIIu specifiche

      • Cell sorter ad alta processività, con cuvetta di tipo quadrato ad alta sensibilità
      • 4 lasers con lunghezze d’onda nearUV (375nm), violet (405nm), blue (488nm) and red (633nm)
      • Acquisizione digitale fino a 70000 eventi/sec
      • Velocità di sorting fino a 20000 eventi/sec
      • Analisi multiparametrica fino a 12 parameteri
      • Nozzle da 70μm, 85μm, 100μm and 130μm
      • Possibilità di sorting a 4 vie in eppendorf da 1.5ml o tubi da 4ml
      • Single cell sorting in piastre da 6-, 24-, 96- and 384- pozzetti o in vetrini per miscroscopia
      Lasers
      (exitation)
      PMTs BP Filters
      (emission)
      Fluorochromes
      (examples)
      *Note: nearUV and Violet lasers cannot be used at the same time.
      Blue
      488 nm
      A FL1 780/80 PE-Cy7, PE-Vio770, Qdot800
      B FL2 698/40 PerCP, PerCP-Cy5.5, PerCP-Vio700, PerCP-eFluor710, 7-AAD, PI
      C FL3 616/23 PE-TexasRed
      D FL4 585/42 PE
      E FL5 530/30 FITC, Alexa 488, GFP, Sytox Green, CFSE, DCFDA
      F SSC 488/10 SSC
      Red
      633 nm
      A FL6 780/60 APC-H7, APC-Vio770, Live/DEAD Near-IR
      B FL7 730/45 AF700
      C FL8 660/20 APC
      Violet
      405 nm*
      A FL9 530/30 V500, VioBlue, AmCyan, BV510, Pacific Orange, LIVE/DEAD Aqua
      B FL10 450/40 V450, VioBlue, Pacific Blue, CellTracker Violet, Zombie violet, AF405
      Near UV
      375 nm*
      A FL9 530/30 Indo-1 (Blue)
      B FL10 450/40 Hoechst Blue, DAPI
    • Citometro a flusso da banco dotato di due sorgenti luminose spazialmente separate: un laser argon, raffreddato ad aria, con emissione a 488 nm ed un laser rosso a diodo (Visible Red Diode Laser) con emissione a 635 nm. La configurazione ottica permette di analizzare fino a 6 parametri di cui 4 di fluorescenza, consentendo la massima flessibilità nella scelta dei fluorocromi.

      Ideato specificatamente per supportare un ampio range di applicazioni, il FACSCalibur è caratterizzato da un elevato livello di automazione (controllo strumentale gestito via software, controllo digitale della fluidica) per garantire l’estrema riproducibilità dei risultati ottenuti.

      La nostra facility si avvale del software FlowJo per l’analisi dei dati. Questo potente software di analisi citfluorimetrica permette l’analisi di dati provenienti da qualsiasi citofluorimetrio e permette l’esecuzione di analisi complesse, rendendo più efficiente, facile e veloce il processo di analisi delle acquisizioni multiparametriche.

      Lasers
      (exitation)
      PMTs BP Filters
      (emission)
      Fluorochromes
      (examples)
      Blue
      488 nm
      A FL1 530/30 FITC, Alexa 488, GFP, Sytox Green, CFSE, DCFDA
      B FL2 585/42 PE
      C FL3 670 LP PerCP, PerCP-Cy5.5, PerCP-Vio700, PerCP-eFluor710, 7-AAD, PI
      Red
      633 nm
      D FL4 661/16 APC
  • Contatti

    Indirizzo

    Servizio di Citofluorimetria e Cell Sorting
    Area Polo Chimico Biomedico ‘CUBO’ – piano terzo
    Via Fossato di Mortara 70 - 44121 Ferrara
    +39 0532 455936/718/849
    +39 0532 455718

    Direttore Tecnico

    Prof. Giorgio Zauli
    giorgio.zauli@unife.it
    +39 0532 455579

    Referente

    Dr Elisabetta Melloni (Ph.D.)
    elisabetta.melloni@unife.it
    +39 0532 455936

    Staff

    Dr Fabio Casciano
    Dr Elisabetta Melloni

    Lo staff si occupa i) dell’accettazione e dell’eventuale processazione/staining dei campioni, ii) della caratterizzazione e/o isolamento delle cellule di interesse, iii) dell’analisi dei risultati, iv) del loro controllo di qualità.

  • Pubblicazioni

    Casciano F, Diani M, Altomare A, Granucci F, Secchiero P, Banfi G, Reali E (2020). CCR4+ Skin-Tropic Phenotype as a Feature of Central Memory CD8+ T Cells in Healthy Subjects and Psoriasis Patients. Front Immunol; 11:529. doi: 10.3389/fimmu.2020.00529. PubMed
    Diani M, Casciano F, Marongiu L, Longhi M, Altomare A, Pigatto PD, Secchiero P, Gambari R, Banfi G, Manfredi AA, Altomare G, Granucci F, Reali E (2019). Increased frequency of activated CD8+ T cell effectors in patients with psoriatic arthritis. Sci Rep; 9(1):10870. doi: 10.1038/s41598-019-47310-5. doi: 10.1038/s41598-019-47310-5. PubMed
    Chiriaco M, Casciano F, Di Matteo G, Gentner B, Claps A, Di Cesare S, Cotugno N, D'Argenio P, Rossi P, Aiuti A, Finocchi A (2018). Impaired X-CGD T cell compartment is gp91phox-NADPH oxidase independent. Clin Immunol; 193:52-59. doi: 10.1016/j.clim.2018.01.010. PubMed
    D'Abundo L, Callegari E, Bresin A, Chillemi A, Elamin BK, Guerriero P, Huang X, Saccenti E, Hussein E, Casciano F, Secchiero P, Zauli G, Calin GA, Russo G, Lee LJ, Croce CM, Marcucci G, Sabbioni S, Malavasi F, Negrini M (2017). Anti-leukemic activity of microRNA-26a in a chronic lymphocytic leukemia mouse model. Oncogene; 36(47):6617-6626. doi: 10.1038/onc.2017.269. PubMed
    Secchiero P, Voltan R, Rimondi E, Melloni E, Athanasakis E, Tisato V, Gallo S, Rigolin GM, Zauli G (2017). The γ-secretase inhibitors enhance the anti-leukemic activity of Ibrutinib in B-CLL cells. Oncotarget; 8(35):59235-59245. doi:10.18632/oncotarget.19494. PubMed
    Feriotto G, Calza R, Bergamini CM, Griffin M, Wang Z, Beninati S, Ferretti V, Marzola E, Guerrini R, Pagnoni A, Cavazzini A, Casciano F, Mischiati C (2016). Involvement of cell surface TG2 in the aggregation of K562 cells triggered by gluten. Amino Acids 49(3):551-565. doi: 10.1007/s00726-016-2339-4. PubMed
    Voltan R, Rimondi E, Melloni E, Gilli P, Bertolasi V, Casciano F, Rigolin GM, Zauli G, Secchiero P (2016). Metformin combined with sodium dichloroacetate promotes B leukemic cell death by suppressing anti-apoptotic protein Mcl-1. Oncotarget 7(14):18965-77. doi: 10.18632/oncotarget.7879. PubMed
    Trapella C, Voltan R, Melloni E, Tisato V, Celeghini C, Bianco S, Fantinati A, Salvadori S, Guerrini R, Secchiero P, Zauli G (2016). Design, Synthesis, and Biological Characterization of Novel Mitochondria Targeted Dichloroacetate-Loaded Compounds with Antileukemic Activity. J Med Chem. 59(1):147-56. doi:10.1021/acs.jmedchem.5b01165. PubMed
    Agnoletto C, Melloni E, Casciano F, Rigolin GM, Rimondi E, Celeghini C, Brunelli L, Cuneo A, Secchiero P, Zauli G (2014). Sodium dichloroacetate exhibits anti-leukemic activity in B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) and synergizes with the p53 activator Nutlin-3. Oncotarget 5:4347-60. doi:10.18632/oncotarget.2018. PubMed
    Athanasakis E, Melloni E, Gian Matteo Rigolin GM, Agnoletto C, Voltan R, Vozzi D, Piscianz E, Segat L, Dal Monego S, Cuneo A, Secchiero P, Zauli G (2014). The p53 transcriptional pathway is preserved in ATMmutated and NOTCH1mutated chronic lymphocytic leukemias. Oncotarget; 5(24):12635-45. doi:10.18632/oncotarget.2211. PubMed
  • Collaborazioni

    • Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara
    • Centro di Riferimento Oncologico (CRO) di Aviano
    • IRCCS Burlo Garofolo di Trieste
    • Azienda Ospedaliera di Cremona
    • Azienda Ospedaliera di Udine
  • Tariffario

    Codice Descrizione sintetica della prestazione offerta Prezzo (€)
    Consulenza preliminare per la formulazione del disegno sperimentale; nel corso della consulenza si potrà effettuare un preventivo del costo complessivo delle analisi richieste.
    Il Servizio offre consulenza per progetti specifici, fornendo preventivi gratuiti in base alle necessità dell’utente.
    Si invita a contattare il referente per esigenze individuali non specificate nel tariffario, in quanto le prestazioni offerte possono essere adattate alle esigenze del cliente.
    Per analisi di routine i prezzi potranno essere concordati (eventuale abbonamento).
    Nessun costo
    CF-01 Immunofenotipizzazione di 1 singolo antigene di superficie.
    La procedura prevede: marcatura, acquisizione ed analisi dei dati.
    60/ora
    CF-02 Immunofenotipizzazioni di 2-4 antigeni di superficie rivelati con anticorpi coniugati con fluorocromi diversi.
    La procedura prevede: marcatura, matrice di compensazione, acquisizione ed analisi dei dati.
    70/ora
    CF-03 Quantificazione dell’apoptosi (monoparametrica con PI).
    La procedura prevede: colorazione, acquisizione ed analisi dei dati.
    50/ora
    CF-04 Quantificazione dell’apoptosi (biparametrica con AnnexinV/PI o 7-AAD).
    La procedura prevede: marcatura, acquisizione ed analisi dei dati.
    70/ora
    CF-05 Analisi del ciclo cellulare (monoparametrica con PI).
    La procedura prevede: colorazione, acquisizione ed analisi dei dati.
    50/ora
    CF-06 Analisi del ciclo cellulare (biparametrica con BrdU-FITC/PI).
    La procedura prevede: marcatura, acquisizione ed analisi dei dati.
    70/ora
    CS-01 Immunofenotipizzazioni di 5 o più antigeni di superficie.
    La procedura prevede: marcatura, matrice di compensazione, acquisizione ed analisi dei dati.
    80/ora
    CS-02 Sorting monoparametrico
    (cellule isolate in base all’espressione di GFP o di 1 antigene di superficie)
    La procedura prevede: marcatura, set-up mediante accudrop test, acquisizione dei dati, sorting, verifica della purezza del sorting.
    85/ora
    CS-03 Sorting multiparametrico
    (cellule isolate in base alla presenza di 2 o più antigeni di superficie)
    La procedura prevede: marcatura, set-up mediante accudrop test, matrice di compensazione, acquisizione dei dati, sorting, verifica della purezza del sorting.
    110/ora
    CFCS-01 Analisi multiparametrica dell’espressione di citochine, fattori di trascrizione, e fosfoproteine mediante l’utilizzo di kit specifici, eventualmente in combinazione con immunofenotipizzazione di superficie.
    La procedura prevede: marcatura, matrice di compensazione, acquisizione ed analisi dei dati.
    Da definire in base alle richieste del cliente
    CFCS-02 Espansione di linee cellulari ed eventuale trattamento con sostanze esogene finalizzati alla fornitura della prestazione di Citofluorimetria o Cell Sorting richiesta. Da concordare con il cliente
    CFCS-03 Consulenza/ corsi tecnico-pratici/ altro Da definire in base alle richieste del cliente

    Alcune prestazioni/prodotti offerti possono usufruire della collaborazione/integrazione con altri servizi del Laboratorio LTTA.
    Ciascun servizio include la fornitura di immagini e/o di files ai fini di eventuali pubblicazioni scientifiche.
    I prezzi sono da intendere senza IVA e soggetti ad aggiornamento in base alle tariffe dei prodotti di consumo necessari per la prestazione (ogni 12 mesi).