Il gruppo di ricerca del Responsabile del Servizio ha una consolidata esperienza nello studio delle proteine della coagulazione del sangue a diversi livelli, dall’investigazione dei livelli di espressione a livello intracellulare e nel plasma, alla caratterizzazione di varianti proteiche naturali ed ingegnerizzate mediante espressione in cellule eucariotiche fino alla modulazione dei loro livelli di espressione mediante intervento a livello trascrizionale, post-trascrizionale e traduzionale.
Il livello dell’attività scientifica svolta dai responsabili è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.
L’attività è incentrata sull’uso di saggi fluorogenici in grado di monitorare l’innesco (generazione di fattore X attivato) e l’amplificazione (generazione di trombina) del processo coagulativo al fine di valutarne l’efficienza in campioni di plasma di soggetti con patologie diverse oppure in plasma carente addizionato con proteine ricombinanti di interesse. Questi approcci sono stati inoltre utilizzati per caratterizzare in termini biochimici varianti naturali ed ingegnerizzate di proteine della coagulazione, ottenute mediante tecnologie ricombinanti ed espressione in cellule eucariotiche.
Il processo emostatico è finemente regolato da un bilancio tra componenti pro-coagulanti ed anti-coagulanti. Tra le componenti pro-coagulanti figurano proteine come fattore VII, IX e X e trombina. Variazioni dei livelli di queste proteine pro- ed anti-coagulanti, determinate da fattori genetici o acquisiti (inclusi trattamenti farmacologici) sono causa di tendenza emorragica oppure protrombotica il cui impatto clinico dipende dall’entità della loro variazione quantitativa. La caratterizzazione di variazioni dei livelli di proteine specifiche ed il loro impatto sul processo fisiologico può essere effettuata mediante studi funzionali effettuati su campioni di plasma. Accanto ai normali saggi della coagulazione sono stati ottimizzati saggi funzionali che consentono di valutare l’efficienza della cascata coagulativa a diversi livelli, dall’innesco alla generazione finale di trombina, l’ultimo effettore dell’intero processo. Questi saggi sfruttano substrati fluorogenici per fattori specifici e possono essere condotti utilizzando microvolumi di plasma. Sono inoltre stati messi a punto saggi di “binding” che permettono di valutare l’interazione di proteine della coagulazione con altre molecole o complessi.
Oltre che fornire informazioni sulla funzionalità del processo coagulativo nell’uomo o nell’animale, queste metodiche possono essere sfruttate per studi di biocompatibilità di biomateriali impiegati per costruire dispositivi e impianti biomedici che vengono in contatto con il sangue, come ad esempio sistemi o filtri per dialisi. Queste interazioni possono determinare l’innesco o l’inibizione della cascata coagulativa, la deplezione di specifiche proteine o complessi macromolecolari della coagulazione, con potenziali impatti di rilevanza fisio-patologica. La conoscenza di queste caratteristiche indirizza verso il disegno dei biomateriali o dispositivi più opportuni.
Saggi funzionali
Saggi fluorogenici in grado di monitorare l’innesco (generazione di fattore X attivato) e l’amplificazione (generazione di trombina) del processo coagulativo al fine di valutarne l’efficienza in campioni di plasma umano in condizioni normali o dopo trattamento/processamento (indicazioni di biocompatibilità). Questi saggi hanno un’elevata sensibilità. Le analisi vengono effettuate su campioni di plasma e su “pool” di plasma normale come riferimento. Inoltre, l’impiego di microvolumi di campione consente un basso consumo del campione stesso e la possibilità di un elevato numero di repliche, permettendo di ottenere una elevata riproducibilità.
Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), dei principali parametri che descrivono l’attività o la capacità coagulativa dei campioni di plasma testati.
Saggi ELISA e di binding
Per le specifiche proteine della coagulazione è possibile l’analisi quantitativa mediante sistemi immunoenzimatici.
Inoltre, sono stati messi a punto saggi di “binding” su micropiastra che consentono di valutare l’interazione di proteine della coagulazione con altre molecole o complessi.
Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), delle costanti che descrivono la capacità di binding delle molecole testate.
Elettroforesi mono- e bidimensionale
L’elettroforesi monodimensionale su gel di poliacrilamide (a concentrazione costante o in gradiente di concentrazione) in condizioni denaturanti e/o riducenti consente di separare le proteine in base al loro peso molecolare. Questo consente l’analisi, sia qualitativa sia semi-quantitativa, del contenuto proteico di miscele complesse (plasma, fluidi biologici, estratti cellulari, supernatanti cellulari) o proteine purificate.
Il servizio è arricchito da altre tecniche correlate:
Le strumentazioni qualificanti presenti sono:
Servizio Interazioni Molecolari, Biomarkers e Delivery
Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate (LTTA)
Area Polo Chimico Biomedico ‘CUBO’ – piano secondo
Via Fossato di Mortara, 70 - 44121 Ferrara
+39 0532 455859 - 455865
Prof. Mirko Pinotti
pnm@unife.it
+39 0532 974424
Dr Alessio Branchini (Ph.D.)
brnlss@unife.it
+39 0532 974421
Dr Alessio Branchini
Dr Marcello Baroni
Malin Bern, Jeannette Nilsen, Mattia Ferrarese, Kine M. K. Sand, Torleif T. Gjølberg, Heidrun E. Lode, Robert J. Davidson, Rodney M. Camire, Espen S. Bækkevold, Stian Foss, Algirdas Grevys, Bjørn Dalhus, John Wilson, Lene S. Høydahl, Gregory J. Christianson, Derry C. Roopenian, Tilman Schlothauer, Terje E. Michaelsen, Morten C. Moe, Silvia Lombardi, Mirko Pinotti, Inger Sandlie, Alessio Branchini and Jan Terje Andersen. An engineered human albumin enhances half-life and transmucosal delivery when fused to protein-based biologics. Science Translational Medicine 14 Oct 2020: Vol. 12, Issue 565, eabb0580. DOI: 10.1126/scitranslmed.abb0580 |
Andersen E, Chollet ME, Baroni M, Pinotti M, Bernardi F, Skarpen E, Sandset PM, Skretting G. The effect of the chemical chaperone 4-phenylbutyrate on secretion and activity of the p.Q160R missense variant of coagulation factor FVII. Cell Biosci. 2019 Aug 27;9:69. doi: 10.1186/s13578-019-0333-8. PubMed |
Marchi S, Corricelli M, Branchini A, Vitto VAM, Missiroli S, Morciano G, Perrone M, Ferrarese M, Giorgi C, Pinotti M, Galluzzi L, Kroemer G, Pinton P. Akt-mediated phosphorylation of MICU1 regulates mitochondrial Ca2+ levels and tumor growth. EMBO J. 2019 Jan 15;38(2):e99435. doi: 10.15252/embj.201899435. PMCID: PMC6331721. PubMed |
Donadon I, McVey JH, Garagiola I, Branchini A, Mortarino M, Peyvandi F, Bernardi F, Pinotti M. Clustered F8 missense mutations cause hemophilia A by combined alteration of splicing and protein biosynthesis and activity. Haematologica. 2018 Feb;103(2):344-350. doi: 10.3324/haematol.2017.178327. PubMed |
Barbon E, Pignani S, Branchini A, Bernardi F, Pinotti M, Bovolenta M (2016) An engineered tale-transcription factor rescues transcription of factor VII impaired by promoter mutations and enhances its endogenous expression in hepatocytes. Sci Rep 6:28304. PubMed |
Branchini A, Ferrarese M, Lombardi S, Mari R, Bernardi F, Pinotti M (2016) Differential functional readthrough over homozygous nonsense mutations contributes to the bleeding phenotype in coagulation factor VII deficiency. J. Thromb. Haemost. 14:1994-2000. PubMed |
Branchini A, Baroni M, Burini F, Puzzo F, Nicolosi F, Mari R, Gemmati D, Bernardi F, Pinotti M (2015) The carboxyl-terminal region is NOT essential for secreted and functional levels of coagulation factor X. J. Thromb. Haemost. 13:1468-74. PubMed |
Branchini A, Baroni M, Pfeiffer C, Batorova A, Giansily-Blaizot M, Schved JF, Mariani G, Bernardi F, Pinotti M (2014) Coagulation factor VII variants resistant to inhibitory antibodies. Thromb. Haemost. 112:972-80. PubMed |
Balestra D, Faella A, Margaritis P, Cavallari N, Pagani F, Bernardi F, Arruda VR, Pinotti M (2014) An engineered U1 small nuclear RNA rescues splicing defective coagulation F7 gene expression in mice. J. Thromb. Haemost. 12:177-85. PubMed |
Branchini A, Campioni M, Mazzucconi MG, Biondo F, Mari R, Bicocchi MP, Bernardi F, Pinotti M (2013) Replacement of the Y450 (c234) phenyl ring in the carboxyl-terminal region of coagulation factor IX causes pleiotropic effects on secretion and enzyme activity. FEBS Lett. 587:3249-53. PubMed |
Olivieri O, Martinelli N, Baroni M, Branchini A, Girelli D, Friso S, Pizzolo F, Bernardi F (2013) Factor II activity is similarly increased in patients with elevated apolipoprotein CIII and in carriers of the factor II 20210A allele. J Am Heart Assoc 2:e000440. PubMed |
Fernandez Alanis E, Pinotti M, Dal Mas A, Balestra D, Cavallari N, Rogalska ME, Bernardi F, Pagani F (2012) An exon-specific U1 small nuclear RNA (snRNA) strategy to correct splicing defects. Hum. Mol. Genet. 21:2389-98. PubMed |
Pinotti M, Caruso P, Canella A, Campioni M, Tagariello G, Castaman G, Giacomelli S, Belvini D, Bernardi F (2012) Ribosome readthrough accounts for secreted full-length factor IX in hemophilia B patients with nonsense mutations. Hum. Mutat. 33:1373-6. PubMed |
Branchini A, Rizzotto L, Mariani G, Napolitano M, Lapecorella M, Giansily-Blaizot M, Mari R, Canella A, Pinotti M, Bernardi F (2012) Natural and engineered carboxy-terminal variants: decreased secretion and gain-of-function result in asymptomatic coagulation factor VII deficiency. Haematologica 97:705-9. PubMed |
Pinotti M, Bernardi F, Dal Mas A, Pagani F (2011) RNA-based therapeutic approaches for coagulation factor deficiencies. J. Thromb. Haemost. 9:2143-52. PubMed |
Casari C, Pinotti M, Lancellotti S, Adinolfi E, Casonato A, De Cristofaro R, Bernardi F (2010) The dominant-negative von Willebrand factor gene deletion p.P1127_C1948delinsR: molecular mechanism and modulation. Blood 116:5371-6. PubMed |
Baroni M, Pavani G, Marescotti D, Kaabache T, Borgel D, Gandrille S, Marchetti G, Legnani C, D'Angelo A, Pinotti M, Bernardi F (2010) Membrane binding and anticoagulant properties of protein S natural variants. Thromb. Res. 125:e33-9. PubMed |
Baroni M, Pizzirani C, Pinotti M, Ferrari D, Adinolfi E, Calzavarini S, Caruso P, Bernardi F, Di Virgilio F (2007) Stimulation of P2 (P2X7) receptors in human dendritic cells induces the release of tissue factor-bearing microparticles. FASEB J. 21:1926-33. PubMed |
Codice | Descrizione sintetica della prestazione offerta | Prezzo (€ per ora) |
Consulenza preliminare per la formulazione del disegno sperimentale; nel corso della consulenza si potrà effettuare un preventivo del costo complessivo delle analisi richieste. Il Servizio offre consulenza per progetti specifici, fornendo preventivi gratuiti in base alle necessità dell’utente. Si invita a contattare il referente per esigenze individuali non specificate nel tariffario, in quanto i pacchetti offerti possono essere modificati in base alle esigenze. Per analisi di routine i prezzi potranno essere concordati (eventuale abbonamento). |
0.00 | |
IM-SC-01 | Saggi su plasma con substrati fluorogenici: I saggi su campioni di plasma di pazienti viene effettuato mediante monitoraggio nel tempo della emissione di fluorescenza a seguito dell’aggiunta di specifici substrati fluorogenici per fattore X attivato o trombina. Eventuali controlli di riferimento prevedono l’utilizzo di pool di plasma normale e/o plasma carente commerciale. Il volume minimo di plasma campione richiesto per ogni singola reazione è 10 µl. Eventuali replicati richiederanno volumi aggiuntivi. Il plasma da testare non deve avere subito scongelamenti e deve giungere presso il Servizio in contenitori con ghiaccio secco. Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), dei principali parametri che descrivono l’attività o la capacità coagulativa dei campioni di plasma testati. |
Chiedere preventivo |
IM-SC-02 | Quantificazione di fattori della coagulazione mediante ELISA: Per specifiche proteine della coagulazione è possibile l’analisi quantitativa, mediante sistemi immunoenzimatici, di campioni di plasma provenienti da pazienti. Come riferimenti verranno utilizzati pool di plasma normale diluito a quantità note, oppure proteina purificata diluita a concentrazione nota. Il volume minimo di plasma campione richiesto per ogni singola reazione è 10 µl. Eventuali replicati richiederanno volumi aggiuntivi. Il plasma da testare non deve avere subito scongelamenti e deve giungere presso il Servizio in contenitori con ghiaccio secco. Il servizio è completato dall’analisi quantitativa mediante software dedicato (GraphPad Prism). |
Chiedere preventivo |
IM-SC-03 | Studi di binding: I saggi di “binding” effettuati su micro piastre da 96 pozzetti consentono di valutare l’interazione di proteine della coagulazione, immobilizzate sul fondo dei pozzetti o utilizzate in soluzione, con altre molecole o complessi. Come riferimenti verranno utilizzate diluizioni di proteine purificate a concentrazione nota. I campioni da testare non devono avere subito scongelamenti e giungere presso il Servizio in contenitori con ghiaccio secco. Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), delle costanti che descrivono la capacità di binding delle molecole testate. |
Chiedere preventivo |
IM-SC-04 | Servizio di elettroforesi mono e bidimensionale: Elettroforesi mono o bidimensionale su gel di poliacrilamide in condizioni denaturanti e/o riducenti per separare le proteine di interesse. Questo consente l’analisi, sia qualitativa sia semi-quantitativa, delle proteine anche in miscele complesse (plasma, fluidi biologici, estratti cellulari, supernatanti cellulari) o proteine purificate. Il servizio è arricchito da altre tecniche correlate: -Colorazione: il gel può essere sottoposto a colorazione tradizionale con sali d’argento o con blu di Coomassie. Sono disponibili anche coloranti fluorescenti e relativa densitometria. -Blotting: il gel può essere sottoposto a procedure di trasferimento su membrane di nitrocellulosa, restituite poi al cliente -Western-blotting: è possibile l’analisi dell’espressione mediante western blotting. |
Chiedere preventivo |
Alcune prestazioni/prodotti offerti possono usufruire della collaborazione/integrazione con altri servizi del Laboratorio LTTA.
Ciascun servizio include la descrizione della procedura e la fornitura di immagini ai fini di eventuali pubblicazioni scientifiche.
I prezzi sono da intendere senza IVA e soggetti ad aggiornamento in base alle tariffe dei prodotti di consumo necessari per la prestazione (ogni 12 mesi).
L’innovativa alpha screen e le diverse applicazioni di Real Time PCR sono tecnologie caratterizzanti il servizio che non solo lo rendono competitivo, ma anche in continua espansione.
L’alpha screen è la tecnologia ideale per lo screening degli effetti di molecole bioattive in termini di attività e interazioni biomolecolari. La tecnologia si realizza mediante l’utilizzo di biglie accettrici e donatrici rivestite di proteine di cui si vuole indagare la bioconiugazione. Se le proteine indagate interagiscono biologicamente, le biglie donatrici e quelle accettrici avvicinandosi danno luogo ad un segnale fluorescente. Infatti, le biglie donatrici, oltre a legare la proteina di interesse, presentano alte concentrazioni di un fotosensibilizzatore che genera più di 60000 molecolele di ossigeno singoletto por secondo. Le biglie accettrici, invece, contengono un derivato del tioxene che reagisce con l’ossigeno singoletto generando un segnale chemiluminescente a 370 nm. Questa energia è immediatamente trasferita ai fluorocromi all’interno della stessa biglia accettrice, con slittamento della lunghezza d’onda d’emissione a 520-620 nm. Il tempo di dimezzamento di 0,3 secondi permette la rivelazione della fluorescenza a tempo risolto. La sensibilità di rilevamento è nell’ordine delle attomoli.
La tecnologia Real Time PCR è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico.
Gli strumenti per PCR Real Time, oltre a fungere da termociclatori, eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la fluorescenza emessa fino ad uno spettrografo. Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica d’amplificazione.
La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche basate sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green o sull'ibridazione di sonde specifiche. La Real Time PCR nel nostro servizio trova applicazione in:
Real Time TaqMan PCR
Tecnologia ampliamente utilizatta per indagare i livelli di espressione di una sequenza target. La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare. Essa presenta all’estremità 5’ un fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza, chiamato "Reporter", ed all’estremità 3’ un "Quencher", ossia un fluorocromo a bassa energia che assorbe la fluorescenza del Reporter. Durante la reazione polimerasica a catena, l'attività 5'-3' esonucleasica della TAQ polimerasi, libera il reporter con emissione di fluorescenza proporzionale alla quantità del prodotto amplificato.
Discriminazione allelica
Saggio in multiplex (più di una sonda per campione) che rileva la variazione di una singola sequenza di acido nucleico. La presenza di due sonde TaqMan® MGB (minor groove binder) in ogni reazione, che hanno come target lo stesso SNP (single-nucleic polymorphism), una perfettamente complementare all’allele wild type e l’altra all’allele mutato, permette la genotipizzazione delle due varianti di un polimorfismo a singolo nucleotide in una sequenza bersaglio. Il genotipo viene definito in base all’intensità relativa emessa dai due fluorocromi.
Melting in alta risoluzione (HRM)
Tecnica che si basa sull’amplificazione di un gene di interesse tramite Real Time PCR e successiva analisi della denaturazione degli ampliconi ottenuti. L’HRM permette di distinguere le differenze di sequenza del DNA analizzando il percorso della curva di melting. L’amplicone viene denaturato in presenza di un fluorocromo intercalante che permette la saturazione totale del DNA senza inibire la reazione di PCR. La saturazione impedisce fenomeni di ricollocazione del fluoroforo durante la fase di melting. Ogni duplex (omoduplex o eteroduplex) esibirà un caratteristico percorso della curva di melting. L’HRM registra questo percorso rilevando il cambiamento nella fluorescenza che avviene durante la fase di dissociazione con incremento della temperatura da DNA double strand a DNA single strand.
L’HRM può essere potenzialmente utilizzata per analizzare tutti i tipi di variazione di sequenza del DNA inclusi cambiamenti di singole basi, inserzioni, delezioni e sostituzioni di coppie di basi.
Il gruppo di ricerca ha una consolidata esperienza nello studio dei marcatori genetici, dei marcatori cellulari di risposta a terapia farmacologiche e nei dosaggi di molecole biologicamente attive.
Il livello dell’attività scientifica del responsabile è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.
L’attività è da anni dedita allo studio delle risposte delle neoplasie solide endocrine ed endocrino-relate a nuove molecole rese disponibili dalla ricerca scientifica.
Biomarkers Facility è un servizio dedicato all’identificazione ed alla caratterizzazione di biomarkers che correlano con l’attività di neoplasie solide nell’ambito endocrino, espandibili ad altri campi di interesse.
A) Test su COLTURE CELLULARI
Mantenimento ed espansione di linee cellulari immortalizzate e successivi saggi con molecole bioattive. Sono disponibili le seguenti linee cellulari:
B) Test su Colture primarie da tessuti umani
Coltura cellulare da espianto tessutale e successivi saggi con molecole bioattive. Abbiamo esperienza nell’ambito dei seguenti tessuti umani:
C) valutazione di parametri cellulari
D) STUDI DI CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO
E) LETTURA DI PIASTRE IN MULTI MODALITA’>
Intensità di fluorescenza, luminescenza, assorbanza (UV, VIS), tecnologia AlphaScreen
F) LETTURA DI PIASTRE ALLESTISTE CON VARIE TECNOLOGIE IN STRUMENTI PER REAL-TIME PCR
Su richiesta i servizi offerti possono essere modificati in base alle esigenze del singolo utente che vi accede.
Le strumentazioni qualificanti sono:
Cappa a flusso laminare, per il mantenimento della sterilità necessaria per le operazioni inerenti alle colture cellulari;
VERITI 96 well thermal Cycler, 7900 HT Real Time fast PCR systems, apparato documentazione fotografica gel doc-it UVP e 3130 Genetic Analyzer strumentazioni indispensabili per l’analisi di marcatori genetici;
EnVision Xcite Multilabel Plate Reader, per analisi che prevedono l’utilizzo di tecniche non-isotopiche come: intensità di fluorescenza, luminescenza, assorbanza (UV, VIS), nonché per l’innovativa tecnologia alpha screen, per lo studio delle vie di trasduzione del segnale.
Servizio di Biomarkers
Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate (LTTA)
Azienda Ospedaliero-Universitaria di Ferrara, Sezione di Endocrinologia – 1E2
Via Aldo Moro 8 - 44124 Cona (Ferrara)
+39 0532 236682
Prof. Maria Chiara Zatelli
ztlmch@unife.it
+39 0532 236682
Dr Giulia Bresciani (Ph.D.)
giulia.bresciani@unife.it
+39 0532 239615
Falletta S, Partelli S, Rubini C, Nann D, Doria A, Marinoni I, Polenta V, Di Pasquale C, Degli Uberti E, Perren A, Falconi M, Zatelli MC (2016) mTOR inhibitors response and mTOR pathway in pancreatic neuroendocrine tumors. Endocr. Relat. Cancer 23:883-891. PubMed |
Martini C, Zanchetta E, Di Ruvo M, Nalesso A, Battocchio M, Gentilin E, Degli Uberti E, Vettor R, Zatelli MC (2016) Cushing in a Leaf: Endocrine Disruption From a Natural Remedy. J. Clin. Endocrinol. Metab. 101:3054-60. PubMed |
Gentilin E, Di Pasquale C, Gagliano T, Tagliati F, Benfini K, Ambrosio MR, Bondanelli M, degli Uberti EC, Zatelli MC (2016) Protein Kinase C Delta restrains growth in ACTH-secreting pituitary adenoma cells. Mol. Cell. Endocrinol. 419:252-8. PubMed |
Beckers A, Lodish MB, Trivellin G, Rostomyan L, Lee M, Faucz FR, Yuan B, Choong CS, Caberg JH, Verrua E, Naves LA, Cheetham TD, Young J, Lysy PA, Petrossians P, Cotterill A, Shah NS, Metzger D, Castermans E, Ambrosio MR, Villa C, Strebkova N, Mazerkina N, Gaillard S, Barra GB, Casulari LA, Neggers SJ, Salvatori R, Jaffrain-Rea ML, Zacharin M, Santamaria BL, Zacharieva S, Lim EM, Mantovani G, Zatelli MC, Collins MT, Bonneville JF, Quezado M, Chittiboina P, Oldfield EH, Bours V, Liu P, W de Herder W, Pellegata N, Lupski JR, Daly AF, Stratakis CA (2015) X-linked acrogigantism syndrome: clinical profile and therapeutic responses. Endocr. Relat. Cancer 22:353-67. PubMed |
Molè D, Gentilin E, Ibañez-Costa A, Gagliano T, Gahete MD, Tagliati F, Rossi R, Pelizzo MR, Pansini G, Luque RM, Castaño JP, degli Uberti E, Zatelli MC (2015) The expression of the truncated isoform of somatostatin receptor subtype 5 associates with aggressiveness in medullary thyroid carcinoma cells. Endocrine 50:442-52. PubMed |
Rossi M, Buratto M, Tagliati F, Rossi R, Lupo S, Trasforini G, Lanza G, Franceschetti P, Bruni S, Degli Uberti E, Zatelli MC (2015) Relevance of BRAF(V600E) mutation testing versus RAS point mutations and RET/PTC rearrangements evaluation in the diagnosis of thyroid cancer. Thyroid 25:221-8. PubMed |
Zatelli MC, Gagliano T, Pelà M, Bianco S, Bertolasi V, Tagliati F, Guerrini R, degli Uberti E, Salvadori S, Trapella C (2014) N-carbamidoyl-4-((3-ethyl-2,4,4-trimethylcyclohexyl)methyl)benzamide enhances staurosporine cytotoxic effects likely inhibiting the protective action of Magmas toward cell apoptosis. J. Med. Chem. 57:4606-14. PubMed |
Gagliano T, Filieri C, Minoia M, Buratto M, Tagliati F, Ambrosio MR, Lapparelli M, Zoli M, Frank G, degli Uberti E, Zatelli MC (2013) Cabergoline reduces cell viability in non functioning pituitary adenomas by inhibiting vascular endothelial growth factor secretion. Pituitary 16:91-100. PubMed |
Gagliano T, Bellio M, Gentilin E, Molè D, Tagliati F, Schiavon M, Cavallesco NG, Andriolo LG, Ambrosio MR, Rea F, Degli Uberti E, Zatelli MC (2013) mTOR, p70S6K, AKT, and ERK1/2 levels predict sensitivity to mTOR and PI3K/mTOR inhibitors in human bronchial carcinoids. Endocr. Relat. Cancer 20:463-75. PubMed |
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Molè D, Gentilin E, Gagliano T, Tagliati F, Bondanelli M, Pelizzo MR, Rossi M, Filieri C, Pansini G, degli Uberti EC, Zatelli MC (2012) Protein kinase C: a putative new target for the control of human medullary thyroid carcinoma cell proliferation in vitro. Endocrinology 153:2088-98. PubMed |
Minoia M, Gentilin E, Molè D, Rossi M, Filieri C, Tagliati F, Baroni A, Ambrosio MR, degli Uberti E, Zatelli MC (2012) Growth hormone receptor blockade inhibits growth hormone-induced chemoresistance by restoring cytotoxic-induced apoptosis in breast cancer cells independently of estrogen receptor expression. J. Clin. Endocrinol. Metab. 97:E907-16. PubMed |
Rossi M, Buratto M, Bruni S, Filieri C, Tagliati F, Trasforini G, Rossi R, Beccati MD, Degli Uberti EC, Zatelli MC (2012) Role of ultrasonographic/clinical profile, cytology, and BRAF V600E mutation evaluation in thyroid nodule screening for malignancy: a prospective study. J. Clin. Endocrinol. Metab. 97:2354-61. PubMed |
Molè D, Gagliano T, Gentilin E, Tagliati F, Pasquali C, Ambrosio MR, Pansini G, Degli Uberti EC, Zatelli MC (2011) Targeting protein kinase C by Enzastaurin restrains proliferation and secretion in human pancreatic endocrine tumors. Endocr. Relat. Cancer 18:439-50. PubMed |
Zatelli MC, Minoia M, Martini C, Tagliati F, Ambrosio MR, Schiavon M, Buratto M, Calabrese F, Gentilin E, Cavallesco G, Berdondini L, Rea F, degli Uberti EC (2010) Everolimus as a new potential antiproliferative agent in aggressive human bronchial carcinoids. Endocr. Relat. Cancer 17:719-29. PubMed |
Romei C, Mariotti S, Fugazzola L, Taccaliti A, Pacini F, Opocher G, Mian C, Castellano M, degli Uberti E, Ceccherini I, Cremonini N, Seregni E, Orlandi F, Ferolla P, Puxeddu E, Giorgino F, Colao A, Loli P, Bondi F, Cosci B, Bottici V, Cappai A, Pinna G, Persani L, Verga U, Uberta V, Boscaro M, Castagna MG, Cappelli C, Zatelli MC, Faggiano A, Francia G, Brandi ML, Falchetti A, Pinchera A, Elisei R, (2010) Multiple endocrine neoplasia type 2 syndromes (MEN 2): results from the ItaMEN network analysis on the prevalence of different genotypes and phenotypes. Eur. J. Endocrinol. 163:301-8. PubMed |
Zatelli MC, Gentilin E, Daffara F, Tagliati F, Reimondo G, Carandina G, Ambrosio MR, Terzolo M, Degli Uberti EC (2010) Therapeutic concentrations of mitotane (o,p'-DDD) inhibit thyrotroph cell viability and TSH expression and secretion in a mouse cell line model. Endocrinology 151:2453-61. PubMed |
Zatelli MC, degli Uberti E (2009) The significance of new somatostatin analogs as therapeutic agents. Curr Opin Investig Drugs 10:1025-31. PubMed |
I responsabili del Servizio hanno numerose collaborazioni con gruppi di ricerca nazionali ed internazionali. Alcuni esempi sono:
BREVETTI INTERNAZIONALI
“Methods of modulating the proliferation of medullary thyroid carcinoma cells” degli Uberti EC, Zatelli MC, Culler, MD. Applicant’s or agent’s file reference: 50165/006W02; Biomeasure Incorporated, Milford, MA, USA; International application number: PCT/US02/06729.
“Pharmaceutical compositions which inhibit proliferation of pituitary adenomas and method of use thereof” degli Uberti EC, Zatelli MC, Culler, MD. Applicant’s or agent’s file reference: 50165/010W02; Biomeasure Incorporated, Milford, MA, USA; International application number: PCT/US02/19998.
"Magmas inhibitors to sensitize tumor cells to therapy" Trapella C, Guerrini R, Salvadori S, Bianco S, Gagliano T, Tagliati F, Zatelli MC, degli Uberti E. International application number: 14230174, depositato il 31 marzo 2014.
BREVETTI NAZIONALI
"Uso di inibitori delle Cicloossigenasi di tipo 2 come agenti atti a modificare la farmacoresistenza cellulare" depositato il 1 Agosto 2005 con N.RM2005A000408.
È prevista una consulenza preliminare per la formulazione del disegno sperimentale; nel corso della quale si potrà effettuare un preventivo del costo complessivo delle analisi richieste.
Il Servizio offre consulenza per progetti specifici, fornendo preventivi gratuiti in base alle necessità dell’utente.
Si invita a contattare il referente per esigenze individuali non specificate nel tariffario, in quanto i pacchetti offerti possono essere modificati.
Per analisi di routine i prezzi potranno essere concordati (eventuale abbonamento).
Codice | Descrizione sintetica della prestazione offerta | Prezzo (€) |
IM-B-001 | Estrazione DNA | Da sangue: 2.00/campione Da pellet cellulare: 2.00/campione Da tessuti: 4.00/campione |
IM-B-002 | Estrazione di acidi nucleici da sezioni paraffinate di tessuto su vetrino | 7.00/vetrino |
IM-B-003 | Estrazione RNA totale con report di qualità | Da sangue: 8.00/campione Da pellet cellulare: 8.00/campione Da tessuti: 12.00/campione |
IM-B-004 | PCR qualitativa | 5.00/reazione |
IM-B-005 | Real Time PCR | Su richiesta in base alla tecnologia necessaria |
IM-B-006 | Disegno primers | 10.00/coppia |
IM-B-007 | Disegno sonda | Per TaqMan Real Time PCR: 5.00/sonda |
IM-B-008 | Lettura piastre in strumenti per real time PCR (allestimento con varie tecnologie) | Senza elaborazione dati: 5.00/piastra |
IM-B-009 | Con elaborazione dati: 10.00/piastra | |
IM-B-010 | Lettura piastre (fluorescenza, luminescenza, assorbanza, tecnologia AlphaScreen) |
Senza elaborazione dati: 2.00/piastra |
IM-B-011 | Con elaborazione dati: 6.00/piastra | |
IM-B-012 | Espansione di linee cellulari endocrine ed endocrino relate (terreno standard) prezzo per fiasca T75/settimana | 20.00 |
IM-B-013 | Coltura primaria da espianto tessutale endocrino ed endocrino relato | 200.00 |
IM-B-014 | Saggio di vitalità cellulare dopo test del farmaco | Se fornita linea cellulare e farmaco: 5.00/campione Se fornito solo il farmaco: 10.00/campione |
IM-B-015 | Saggio in luminescenza dell’attività delle caspasi 3/7 | 5.00/campione |
IM-B-016 | Quantificazione della secrezione ormonale dopo test del farmaco | Su richiesta |
IM-B-017 | Alpha screen | 1000.00-3000.00 prezzo variabile a seconda del numero di campioni e del numero delle vie di trasduzione del segnale da analizzare |
IM-B-018 | Saggi di attività luciferasica | Su richiesta |
Mini-kit di saggi degli effetti di sostanze esogene in colture cellulari continue o in colture primarie | ||
1-Saggi di vitalità su colture cellulari | ||
IM-B-019 | Espansione linea cellulare con test degli effetti di sostanze esogene mediante saggio di vitalità colorimetrico o in luminescenza e saggi di attivazione delle caspasi | Da concordare |
IM-B-020 | Allestimento e coltura di linea cellulare primaria con test degli effetti di sostanze esogene mediante saggio di vitalità colorimetrico o in luminescenza e saggi di attivazione delle caspasi | Da concordare |
2-Saggi di funzionalità cellulare | ||
IM-B-021 | Dosaggio di sostanze bioattive secrete nel mezzo di coltura cellulare | Da concordare |
IM-B-022 | Analisi qualitativa e quantitativa di espressione genica nella coltura cellulare in risposta a sostanze esogene | Da concordare |
IM-B-023 | Analisi di pathway intracellulari in risposta a sostanze esogene | Da concordare |
3-Studi di correlazione genotipo-fenotipo | ||
IM-B-024 | Estrazione di DNA ed analisi di marcatori genetici in colture cellulari/tessuti | Da concordare |
Alcune prestazioni/prodotti offerti possono usufruire della collaborazione/integrazione con altri servizi del Laboratorio LTTA.
Ciascun servizio include la descrizione della procedura e la fornitura di immagini ai fini di eventuali pubblicazioni scientifiche.
I prezzi sono da intendere senza IVA e soggetti ad aggiornamento in base alle tariffe dei prodotti di consumo necessari per la prestazione (ogni 12 mesi).
I responsabili del servizio hanno una pluridecennale esperienza nella sintesi, purificazione e caratterizzazione di molecole organiche, peptidiche e peptidomimetiche. I responsabili del servizio nel corso della loro attività accademica hanno identificato numerose molecole bioattive in grado di interagire con recettori accoppiati a proteine G (GPCRs). In particolare sono sati identificati composti in grado di interagire (come agonisti, antagonisti e agonisti parziali) con i recettori oppioidi, il recettore della nocicettina, il recettore dell’urotensina e il recettore del neuropeptide S. Diverse molecole identificate dai responsabili del servizio sono ora disponibili in commercio e utilizzate come standard di riferimento in molti laboratori accademici e industriali che lavorano nel campo dei GPCR.
Il livello dell’attività scientifica dei responsabili è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.
Recentemente, attraverso una collaborazione tra la sezione di Neurologia dell’ospedale S.Anna di Ferrara e la ditta Genzyme di Boston (USA) è stata dimostrata l’efficacia di un enzima ricombinante (Miozyme)nel trattamento di una malattia metabolica rara quale la malattia di Pompe. Utilizzando la spettrometria di massa si è valutata la presenza di glucosio marcato nel plasma dei pazienti affetti. Nell’ambito dello stesso progetto si sono identificati anche alcuni tetra-saccaridi marcati nelle urine dei medesimi pazienti.
L’HPLC (High Performance Liquid Chromatography) è uno strumento analitico derivato dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi. Nella cromatografia classica il componente principale è la colonna che contiene la fase stazionaria all’interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall’eluente. Il passaggio dell’eluente avviene tramite la spinta esercitata dalla colonna di liquido costituente la fase mobile e quindi il processo, se la fase stazionaria non è abbastanza porosa, può essere anche molto lento. La separazione dei componenti avviene tramite interazioni che si creano fra i costituenti della miscela e le due fasi. Le interazioni possono essere di tipo elettrostatico, dipolo-dipolo, forze di Van Der Waals oppure tramite un meccanismo di scambio ionico. Questo dipende dalle proprietà sia delle due fasi sia della miscela da separare. Nell’HPLC la forza che permette all’eluente di scorrere nella colonna, è rappresentata dalla pressione che è applicata da una pompa in testa alla colonna e forza la fase mobile a scorrere all’interno della fase stazionaria. Questo permette non solo di rendere il processo più rapido ma permette anche di ottenere un maggior numero di piatti teorici il che vuol dire una migliore risoluzione. Il piatto teorico di una colonna cromatografia corrisponde a quel tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l’eludente la trascini ad uno stadio successivo. Pertanto, minore e’ lo spessore del piatto teorico maggiore sara’ l’efficienza della colonna. I primi sviluppi positivi nella cromatografia liquida furono fatti dopo che si ipotizzò e si costatò che la diminuzione dello spessore del piatto teorico si poteva ottenere impaccando la colonna con particelle di diametro più piccolo. Solo alla fine degli anni ’60 è stata sviluppata una tecnologia adatta alla fabbricazione di particelle di grandezza variabile dai 5 ai 10 μm per impaccare le colonne. Il nome di High Performance Liquid Chromatography (HPLC) serve quindi a distinguere questa nuova tecnologia cromatografica dalla cromatografia classica.
La spettrometria di massa è stata descritta come la bilancia più piccola del mondo, non per le dimensioni degli strumenti, ma per la grandezza delle masse che va a misurare: la massa delle molecole. Negli ultimi decenni la spettrometria di massa ha visto importanti sviluppi tecnologici che ora ne permettono l’utilizzo per la determinazione di peptidi, proteine, acidi nucleici, carboidrati, farmaci ed altre molecole di rilevanza biologica.
Grazie alle sorgenti di ionizzazione quali ESI (Electro Spray Ionization) e MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) la spettrometria di massa è divenuta uno strumento indispensabile nelle scienze biologiche.
Uno spettrometro di massa determina la massa, cioè il peso molecolare, di molecule attraverso la misurazione del loro rapporto massa su carica (m/z). Gli ioni necessari per questa determinazione sono generati dalle rispettive molecule neutre per perdita o acquisizione di una carica elettrica. Una volta formate le speci cariche queste sono indirizzate all’analizzatore di massa dove vengono separate in base al loro rapporto massa/carica ed alla fine rilevate. Il risultato della ionizzazione molecolare, separazione e rilevazione è uno spettro di massa che determina il peso molecolare della/e sostanza/e presente/i nel campione.
Determinazione della massa esatta di un analita
Il servizio prevede la determinazione della massa accurata di un composto, sia puro sia in miscela utilizzando la tecnologia HPLC-Chip-MS-Q-TOF installata sullo strumento Agilent ESI-Q-TOF 6520®. Questo spettrometro di massa accoppiato con un nano HPLC Chip Cube® di Agilent con doppio quadrupolo ed analizzatore a tempo di volo (TOF) permette la determinazione della massa esatta (con un errore di meno di 2 ppm) di molecole con una massa compresa tra 200 e 20.000 Daltons. La possibilità di separare miscele complesse attraverso il nano-HPLC permette l’analisi di metaboliti in fluidi biologici ed attraverso la loro massa esatta anche la struttura della molecola. Quest’ultima possibilità è permessa grazie alla trappola ionica a quadrupolo che attraverso l’analisi massa massa (MS/MS) determina la struttura molecolare o la sequenza di un peptide.
Nano-HPLC-Chip-Cube® HRMS Agilent 6520 ESI-Q-TOF
Servizio Interazioni Molecolari, Biomarkers e Delivery
Laboratorio per le Tecnologie delle Terapie Avanzate (LTTA Centre)
Area Polo Chimico Biomedico "CUBO" - secondo piano
Via Fossato di Mortara 70 - 44121 Ferrara
+39 0532 455859 - 455856 - 455767
Prof. Remo Guerrini
remo.guerrini@unife.it
+39 0532 455988
Dr Claudio Trapella (Ph.D., AMRSC)
claudio.trapella@unife.it
+39 0532 455924
Dr Erika Marzola
Prof. Claudio Trapella
Dr Anna Talarico
anna.talarico@unife.it
Prof. Matteo Marti
matteo.marti@unife.it
Prof. Margherita Neri
margherita.neri@unife.it
Ruzza C, Rizzi A, Malfacini D, Cerlesi MC, Ferrari F, Marzola E, Ambrosio C, Gro C, Severo S, Costa T, Calo G, Guerrini R (2014) Pharmacological characterization of tachykinin tetrabranched derivatives. Br. J. Pharmacol. 171:4125-37. PubMed |
Pelà M, Saxena P, Luciani R, Santucci M, Ferrari S, Marverti G, Marraccini C, Martello A, Pirondi S, Genovese F, Salvadori S, D'Arca D, Ponterini G, Costi MP, Guerrini R (2014) Optimization of peptides that target human thymidylate synthase to inhibit ovarian cancer cell growth. J. Med. Chem. 57:1355-67. PubMed |
Oishi M, Kushikata T, Niwa H, Yakoshi C, Ogasawara C, Calo G, Guerrini R, Hirota K (2014) Endogenous neuropeptide S tone influences sleep-wake rhythm in rats. Neurosci. Lett. 581:94-7. PubMed |
Pelà M, Del Zoppo L, Allegri L, Marzola E, Ruzza C, Calo G, Perissutti E, Frecentese F, Salvadori S, Guerrini R (2014) Racemic synthesis and solid phase peptide synthesis application of the chimeric valine/leucine derivative 2-amino-3,3,4-trimethyl-pentanoic acid. Pharmazie 69:496-9. PubMed |
Smilkov K, Janevik E, Guerrini R, Pasquali M, Boschi A, Uccelli L, Di Domenico G, Duatti A (2014) Preparation and first biological evaluation of novel Re-188/Tc-99m peptide conjugates with substance-P. Appl Radiat Isot 92:25-31. PubMed |
Rizzi A, Malfacini D, Cerlesi MC, Ruzza C, Marzola E, Bird MF, Rowbotham DJ, Salvadori S, Guerrini R, Lambert DG, Calo G (2014) In vitro and in vivo pharmacological characterization of nociceptin/orphanin FQ tetrabranched derivatives. Br. J. Pharmacol. 171:4138-53. PubMed |
Guerrini R, Marzola E, Trapella C, Pela' M, Molinari S, Cerlesi MC, Malfacini D, Rizzi A, Salvadori S, Calo' G (2014) A novel and facile synthesis of tetra branched derivatives of nociceptin/orphanin FQ. Bioorg. Med. Chem. 22:3703-12. PubMed |
Zatelli MC, Gagliano T, Pelà M, Bianco S, Bertolasi V, Tagliati F, Guerrini R, degli Uberti E, Salvadori S, Trapella C (2014) N-carbamidoyl-4-((3-ethyl-2,4,4-trimethylcyclohexyl)methyl)benzamide enhances staurosporine cytotoxic effects likely inhibiting the protective action of Magmas toward cell apoptosis. J. Med. Chem. 57:4606-14. PubMed |
Molinari S, Camarda V, Rizzi A, Marzola G, Salvadori S, Marzola E, Molinari P, McDonald J, Ko MC, Lambert DG, Calo' G, Guerrini R (2013) [Dmt1]N/OFQ(1-13)-NH2: a potent nociceptin/orphanin FQ and opioid receptor universal agonist. Br. J. Pharmacol. 168:151-62. PubMed |
Thompson AA, Liu W, Chun E, Katritch V, Wu H, Vardy E, Huang XP, Trapella C, Guerrini R, Calo G, Roth BL, Cherezov V, Stevens RC (2012) Structure of the nociceptin/orphanin FQ receptor in complex with a peptide mimetic. Nature 485:395-9. PubMed |
I responsabili del Servizio hanno numerose collaborazioni con gruppi di ricerca nazionali ed internazionali. Alcuni esempi sono:
University Depts. Cardiovascular Sciences, Div. Anaesthesia, Critical Care and Pain Management, Leicester Royal Infirmary, Leicester UK.
Université Pierre et Marie Curie - UPMC, UMR 7201 CNRS, Institut Parisien de Chimie Moléculaire IPCM, 4, Place Jussieu, Bâtiment F, 2ème étage, porte 217, boîte 183, 75252, Paris, Cedex 05, France.
Department of Organic and Medicinal Chemistry University of Granada (Spain) Prof.ssa Maria del Carmen Nunez Carretero.
Dipartimento di Chimica, Università degli Studi di Napoli "Federico II", Complesso Universitario di Monte S. Angelo, via Cintia, 80126 Napoli, Italy.
National Institute for Medical Research, Medical research Cuncil, The ridgeway, Mill Hill, London NW7 1AA, UK.
BREVETTI INTERNAZIONALI
“Analogs of Nociceptin” Guerrini R, Calo’ G, Salvadori S, Regoli D. Application number: EP 1422240.
“Highly potent full and partial agonists and antagonists of the nociceptin/orphanin FQ receptor” Guerrini R, Calo' G, Regoli D, Salvadori S. Application number: PCT/EP2006/050958; WO2006087340.
“Biologically potent analogues of the Dmt-Tic pharmacophore and methods of use” Lazarus L H, Salvadori S, Balboni G, Guerrini R. Application number: US 2006-0104907.
“Magmas Inhibitors to sensitize tumor cells to therapy” Zatelli MC, Tagliati F, degli Uberti E, Gagliano T. Salvadori S. Guerrini R. Bianco S. Trapella C. Application number: US- EFS ID: 18623727-2014.
Codice | Descrizione sintetica della prestazione offerta | Prezzo (€ per ora) |
Consulenza preliminare per la formulazione del disegno sperimentale; nel corso della consulenza si potrà effettuare un preventivo del costo complessivo delle analisi richieste. Il Servizio offre consulenza per progetti specifici, fornendo preventivi gratuiti in base alle necessità dell’utente. Si invita a contattare il referente per esigenze individuali non specificate nel tariffario,in quanto i pacchetti offerti possono essere modificati in base alle esigenze. Per analisi di routine i prezzi potranno essere concordati (eventuale abbonamento). |
0.00 | |
SERVIZIO DI CROMATOGRAFIA HPLC E SPETTROMETRIA DI MASSA | ||
LTTA-IM-CHSM-02 | Messa a punto del metodo | 800.00 |
LTTA-IM-CHSM-02 | Costo per ogni analisi | 120.00 |
Alcune prestazioni/prodotti offerti possono usufruire della collaborazione/integrazione con altri servizi del Laboratorio LTTA.
Ciascun servizio include la descrizione della procedura e la fornitura di immagini ai fini di eventuali pubblicazioni scientifiche.
I prezzi sono da intendere senza IVA e soggetti ad aggiornamento in base alle tariffe dei prodotti di consumo necessari per la prestazione (ogni 12 mesi).