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Competenze e Tecnologie

I responsabili del servizio hanno una pluridecennale esperienza nella sintesi, purificazione e caratterizzazione di molecole organiche, peptidiche e peptidomimetiche. I responsabili del servizio nel corso della loro attività accademica hanno identificato numerose molecole bioattive in grado di interagire con recettori accoppiati a proteine G (GPCRs). In particolare sono sati identificati composti in grado di interagire (come agonisti, antagonisti e agonisti parziali) con i recettori oppioidi, il recettore della nocicettina, il recettore dell’urotensina e il recettore del neuropeptide S. Diverse molecole identificate dai responsabili del servizio sono ora disponibili in commercio e utilizzate come standard di riferimento in molti laboratori accademici e industriali che lavorano nel campo dei GPCR.

Il livello dell’attività scientifica dei responsabili è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.

Recentemente, attraverso una collaborazione tra la sezione di Neurologia dell’ospedale S.Anna di Ferrara e la ditta Genzyme di Boston (USA) è stata dimostrata l’efficacia di un enzima ricombinante (Miozyme)nel trattamento di una malattia metabolica rara quale la malattia di Pompe. Utilizzando la spettrometria di massa si è valutata la presenza di glucosio marcato nel plasma dei pazienti affetti. Nell’ambito dello stesso progetto si sono identificati anche alcuni tetra-saccaridi marcati nelle urine dei medesimi pazienti.

L’HPLC (High Performance Liquid Chromatography) è uno strumento analitico derivato dalla cromatografia classica e si basa sugli stessi principi. Nella cromatografia classica il componente principale è la colonna che contiene la fase stazionaria all’interno della quale scorre la fase mobile rappresentata dall’eluente. Il passaggio dell’eluente avviene tramite la spinta esercitata dalla colonna di liquido costituente la fase mobile e quindi il processo, se la fase stazionaria non è abbastanza porosa, può essere anche molto lento. La separazione dei componenti avviene tramite interazioni che si creano fra i costituenti della miscela e le due fasi. Le interazioni possono essere di tipo elettrostatico, dipolo-dipolo, forze di Van Der Waals oppure tramite un meccanismo di scambio ionico. Questo dipende dalle proprietà sia delle due fasi sia della miscela da separare. Nell’HPLC la forza che permette all’eluente di scorrere nella colonna, è rappresentata dalla pressione che è applicata da una pompa in testa alla colonna e forza la fase mobile a scorrere all’interno della fase stazionaria. Questo permette non solo di rendere il processo più rapido ma permette anche di ottenere un maggior numero di piatti teorici il che vuol dire una migliore risoluzione. Il piatto teorico di una colonna cromatografia corrisponde a quel tratto di colonna nel quale una specie chimica si trova in equilibrio fra le due fasi (stazionaria e mobile) prima che l’eludente la trascini ad uno stadio successivo. Pertanto, minore e’ lo spessore del piatto teorico maggiore sara’ l’efficienza della colonna. I primi sviluppi positivi nella cromatografia liquida furono fatti dopo che si ipotizzò e si costatò che la diminuzione dello spessore del piatto teorico si poteva ottenere impaccando la colonna con particelle di diametro più piccolo. Solo alla fine degli anni ’60 è stata sviluppata una tecnologia adatta alla fabbricazione di particelle di grandezza variabile dai 5 ai 10 μm per impaccare le colonne. Il nome di High Performance Liquid Chromatography (HPLC) serve quindi a distinguere questa nuova tecnologia cromatografica dalla cromatografia classica.

La spettrometria di massa è stata descritta come la bilancia più piccola del mondo, non per le dimensioni degli strumenti, ma per la grandezza delle masse che va a misurare: la massa delle molecole. Negli ultimi decenni la spettrometria di massa ha visto importanti sviluppi tecnologici che ora ne permettono l’utilizzo per la determinazione di peptidi, proteine, acidi nucleici, carboidrati, farmaci ed altre molecole di rilevanza biologica.

Grazie alle sorgenti di ionizzazione quali ESI (Electro Spray Ionization) e MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization) la spettrometria di massa è divenuta uno strumento indispensabile nelle scienze biologiche.

Uno spettrometro di massa determina la massa, cioè il peso molecolare, di molecule attraverso la misurazione del loro rapporto massa su carica (m/z). Gli ioni necessari per questa determinazione sono generati dalle rispettive molecule neutre per perdita o acquisizione di una carica elettrica. Una volta formate le speci cariche queste sono indirizzate all’analizzatore di massa dove vengono separate in base al loro rapporto massa/carica ed alla fine rilevate. Il risultato della ionizzazione molecolare, separazione e rilevazione è uno spettro di massa che determina il peso molecolare della/e sostanza/e presente/i nel campione.

Determinazione della massa esatta di un analita
Il servizio prevede la determinazione della massa accurata di un composto, sia puro sia in miscela utilizzando la tecnologia HPLC-Chip-MS-Q-TOF installata sullo strumento Agilent ESI-Q-TOF 6520®. Questo spettrometro di massa accoppiato con un nano HPLC Chip Cube ® di Agilent con doppio quadrupolo ed analizzatore a tempo di volo (TOF) permette la determinazione della massa esatta (con un errore di meno di 2 ppm) di molecole con una massa compresa tra 200 e 20.000 Daltons. La possibilità di separare miscele complesse attraverso il nano-HPLC permette l’analisi di metaboliti in fluidi biologici ed attraverso la loro massa esatta anche la struttura della molecola. Quest’ultima possibilità è permessa grazie alla trappola ionica a quadrupolo che attraverso l’analisi massa massa (MS/MS) determina la struttura molecolare o la sequenza di un peptide.

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