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Competenze e Tecnologie

Il gruppo di ricerca del Responsabile del Servizio ha una consolidata esperienza nello studio delle proteine della coagulazione del sangue a diversi livelli, dall’investigazione dei livelli di espressione a livello intracellulare e nel plasma, alla caratterizzazione di varianti proteiche naturali ed ingegnerizzate mediante espressione in cellule eucariotiche fino alla modulazione dei loro livelli di espressione mediante intervento a livello trascrizionale, post-trascrizionale e traduzionale.

Il livello dell’attività scientifica svolta dai responsabili è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.

L’attività è incentrata sull’uso di saggi fluorogenici in grado di monitorare l’innesco (generazione di fattore X attivato) e l’amplificazione (generazione di trombina) del processo coagulativo al fine di valutarne l’efficienza in campioni di plasma di soggetti con patologie diverse oppure in plasma carente addizionato con proteine ricombinanti di interesse. Questi approcci sono stati inoltre utilizzati per caratterizzare in termini biochimici varianti naturali ed ingegnerizzate di proteine della coagulazione, ottenute mediante tecnologie ricombinanti ed espressione in cellule eucariotiche.

Il processo emostatico è finemente regolato da un bilancio tra componenti pro-coagulanti ed anti-coagulanti. Tra le componenti pro-coagulanti figurano proteine come fattore VII, IX e X e trombina. Variazioni dei livelli di queste proteine pro- ed anti-coagulanti, determinate da fattori genetici o acquisiti (inclusi trattamenti farmacologici) sono causa di tendenza emorragica oppure protrombotica il cui impatto clinico dipende dall’entità della loro variazione quantitativa. La caratterizzazione di variazioni dei livelli di proteine specifiche ed il loro impatto sul processo fisiologico può essere effettuata mediante studi funzionali effettuati su campioni di plasma. Accanto ai normali saggi della coagulazione sono stati ottimizzati saggi funzionali che consentono di valutare l’efficienza della cascata coagulativa a diversi livelli, dall’innesco alla generazione finale di trombina, l’ultimo effettore dell’intero processo. Questi saggi sfruttano substrati fluorogenici per fattori specifici e possono essere condotti utilizzando microvolumi di plasma. Sono inoltre stati messi a punto saggi di “binding” che permettono di valutare l’interazione di proteine della coagulazione con altre molecole o complessi.

Oltre che fornire informazioni sulla funzionalità del processo coagulativo nell’uomo o nell’animale, queste metodiche possono essere sfruttate per studi di biocompatibilità di biomateriali impiegati per costruire dispositivi e impianti biomedici che vengono in contatto con il sangue, come ad esempio sistemi o filtri per dialisi. Queste interazioni possono determinare l’innesco o l’inibizione della cascata coagulativa, la deplezione di specifiche proteine o complessi macromolecolari della coagulazione, con potenziali impatti di rilevanza fisio-patologica. La conoscenza di queste caratteristiche indirizza verso il disegno dei biomateriali o dispositivi più opportuni.

Saggi funzionali

Saggi fluorogenici in grado di monitorare l’innesco (generazione di fattore X attivato) e l’amplificazione (generazione di trombina) del processo coagulativo al fine di valutarne l’efficienza in campioni di plasma umano in condizioni normali o dopo trattamento/processamento (indicazioni di biocompatibilità). Questi saggi hanno un’elevata sensibilità. Le analisi vengono effettuate su campioni di plasma e su “pool” di plasma normale come riferimento. Inoltre, l’impiego di microvolumi di campione consente un basso consumo del campione stesso e la possibilità di un elevato numero di repliche, permettendo di ottenere una elevata riproducibilità.

Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), dei principali parametri che descrivono l’attività o la capacità coagulativa dei campioni di plasma testati.


Saggi ELISA e di binding

Per le specifiche proteine della coagulazione è possibile l’analisi quantitativa mediante sistemi immunoenzimatici.

Inoltre, sono stati messi a punto saggi di “binding” su micropiastra che consentono di valutare l’interazione di proteine della coagulazione con altre molecole o complessi.

Il servizio è completato dall’analisi, mediante software dedicato (GraphPad Prism), delle costanti che descrivono la capacità di binding delle molecole testate.


Elettroforesi mono- e bidimensionale

L’elettroforesi monodimensionale su gel di poliacrilamide (a concentrazione costante o in gradiente di concentrazione) in condizioni denaturanti e/o riducenti consente di separare le proteine in base al loro peso molecolare. Questo consente l’analisi, sia qualitativa sia semi-quantitativa, del contenuto proteico di miscele complesse (plasma, fluidi biologici, estratti cellulari, supernatanti cellulari) o proteine purificate.

Il servizio è arricchito da altre tecniche correlate:

  • Colorazione: il gel può essere sottoposto a colorazione tradizionale con sali d’argento o con blu di Coomassie. Sono disponibili anche coloranti fluorescenti e relativa densitometria.
  • Blotting: il gel può essere sottoposto a procedure di trasferimento su membrane di nitrocellulosa, restituite poi al cliente
  • Western-blotting: per le proteine conosciute, è possibile l’analisi dell’espressione mediante western blotting.

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