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Competenze e Tecnologie

L’innovativa alpha screen e le diverse applicazioni di Real Time PCR sono tecnologie caratterizzanti il servizio che non solo lo rendono competitivo, ma anche in continua espansione.

L’alpha screen è la tecnologia ideale per lo screening degli effetti di molecole bioattive in termini di attività e interazioni biomolecolari. La tecnologia si realizza mediante l’utilizzo di biglie accettrici e donatrici rivestite di proteine di cui si vuole indagare la bioconiugazione. Se le proteine indagate interagiscono biologicamente, le biglie donatrici e quelle accettrici avvicinandosi danno luogo ad un segnale fluorescente. Infatti, le biglie donatrici, oltre a legare la proteina di interesse, presentano alte concentrazioni di un fotosensibilizzatore che genera più di 60000 molecolele di ossigeno singoletto por secondo. Le biglie accettrici, invece, contengono un derivato del tioxene che reagisce con l’ossigeno singoletto generando un segnale chemiluminescente a 370 nm. Questa energia è immediatamente trasferita ai fluorocromi all’interno della stessa biglia accettrice, con slittamento della lunghezza d’onda d’emissione a 520-620 nm. Il tempo di dimezzamento di 0,3 secondi permette la rivelazione della fluorescenza a tempo risolto. La sensibilità di rilevamento è nell’ordine delle attomoli.

La tecnologia Real Time PCR è in grado di misurare in tempo reale la concentrazione iniziale di una sequenza target in un campione biologico.

Gli strumenti per PCR Real Time, oltre a fungere da termociclatori, eccitano i fluorocromi presenti nei campioni e convogliano quindi la fluorescenza emessa fino ad uno spettrografo. Appositi software acquisiscono lo spettro di emissione di ogni singolo campione per tutta la durata della PCR e convertono la variazione di fluorescenza del reporter in una rappresentazione in tempo reale della cinetica d’amplificazione.

La fluorescenza si genera durante la PCR per effetto di diverse possibili reazioni chimiche basate sul legame di coloranti fluorescenti che si intercalano nella doppia elica di DNA, come il SYBR Green o sull'ibridazione di sonde specifiche. La Real Time PCR nel nostro servizio trova applicazione in:

  • Real Time TaqMan PCR
    Tecnologia ampliamente utilizatta per indagare i livelli di espressione di una sequenza target. La sonda di tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come i primers della PCR, viene disegnato per essere complementare alla sequenza bersaglio da amplificare. Essa presenta all’estremità 5’ un fluorocromo ad alta energia che emette fluorescenza, chiamato "Reporter", ed all’estremità 3’ un "Quencher", ossia un fluorocromo a bassa energia che assorbe la fluorescenza del Reporter. Durante la reazione polimerasica a catena, l'attività 5'-3' esonucleasica della TAQ polimerasi, libera il reporter con emissione di fluorescenza proporzionale alla quantità del prodotto amplificato.
  • Discriminazione allelica
    Saggio in multiplex (più di una sonda per campione) che rileva la variazione di una singola sequenza di acido nucleico. La presenza di due sonde TaqMan® MGB (minor groove binder) in ogni reazione, che hanno come target lo stesso SNP (single-nucleic polymorphism), una perfettamente complementare all’allele wild type e l’altra all’allele mutato, permette la genotipizzazione delle due varianti di un polimorfismo a singolo nucleotide in una sequenza bersaglio. Il genotipo viene definito in base all’intensità relativa emessa dai due fluorocromi.
  •  

  • Melting in alta risoluzione (HRM)
    Tecnica che si basa sull’amplificazione di un gene di interesse tramite Real Time PCR e successiva analisi della denaturazione degli ampliconi ottenuti. L’HRM permette di distinguere le differenze di sequenza del DNA analizzando il percorso della curva di melting. L’amplicone viene denaturato in presenza di un fluorocromo intercalante che permette la saturazione totale del DNA senza inibire la reazione di PCR. La saturazione impedisce fenomeni di ricollocazione del fluoroforo durante la fase di melting. Ogni duplex (omoduplex o eteroduplex) esibirà un caratteristico percorso della curva di melting. L’HRM registra questo percorso rilevando il cambiamento nella fluorescenza che avviene durante la fase di dissociazione con incremento della temperatura da DNA double strand a DNA single strand.

    L’ HRM può essere potenzialmente utilizzata per analizzare tutti i tipi di variazione di sequenza del DNA inclusi cambiamenti di singole basi, inserzioni, delezioni e sostituzioni di coppie di basi

 

Il gruppo di ricerca ha una consolidata esperienza nello studio dei marcatori genetici, dei marcatori cellulari di risposta a terapia farmacologiche e nei dosaggi di molecole biologicamente attive.

Il livello dell’attività scientifica del responsabile è testimoniata da numerose pubblicazioni su prestigiose riviste internazionali.

L’attività è da anni dedita allo studio delle risposte delle neoplasie solide endocrine ed endocrino-relate a nuove molecole rese disponibili dalla ricerca scientifica.

Biomarkers Facility è un servizio dedicato all’identificazione ed alla caratterizzazione di biomarkers che correlano con l’attività di neoplasie solide nell’ambito endocrino, espandibili ad altri campi di interesse.

A) Test su COLTURE CELLULARI

Mantenimento ed espansione di linee cellulari immortalizzate e successivi saggi con molecole bioattive. Sono disponibili le seguenti linee cellulari:

  1. linee cellulari murine
    • AtT20, AtT20/D16v-F2: adenoma ipofisario secernente ACTH
    • LβT2: adenoma ipofisario secernente LH
    • αT3-1: adenoma ipofisario secernente α subunità
  2. linee cellulari di ratto
    • GH3, GH1, GH4: adenoma ipofisario secernente GH
    • MMQ: adenoma ipofisario secernente PRL
  3. linee cellulari umane
    • NCI-H295: carcinoma del corticosurrene
    • NCI-H720: carcinoma bronchiale atipico
    • NCI-H727: carcinoma bronchiale tipico
    • TT: carcinoma midollare della tiroide
    • FTC-133: carcinoma follicolare della tiroide
    • Nthy-ORI: cellule follicolari normali della tiroide
    • BON-1: carcinoma neuroendocrino non secernente del pancreas
    • MCF7: carcinoma della mammella, positivo per i recettori degli estrogeni
    • MDA-MD 231: carcinoma della mammella, negativo per i recettori degli estrogeni
    • MCF12: epitelio mammario normale
    • SW13: carcinoma del corticosurrene
    • AN3CA: carcinoma dell'endometrio, negativo per il recettore degli estrogeni
    • HEC1A: carcinoma dell'endometrio, positivo per il recettore degli estrogeni
    • T-HESK: endometrio normale
  4. linea cellulare canina
    • MDCK1: epitelio renale normale

 

B) Test su Colture primarie da tessuti umani

Coltura cellulare da espianto tessutale e successivi saggi con molecole bioattive. Abbiamo esperienza nell’ambito dei seguenti tessuti umani:

  • adenomi ipofisari
  • carcinoma midollare della tiroide
  • carcinoma differenziato della tiroide
  • carcinoidi bronchiali
  • feocromocitoma
  • carcinoma ed adenoma del surrene
  • carcinoma neuroendocrino del pancreas
  • neoplasie endocrine benigne e maligne del tratto gastro-intestinale

 

C) valutazione di parametri cellulari

  • vitalità cellulare, mediante saggi MTT o quantificazione di ATP
  • apoptosi (es. valutazione dell’attività delle caspasi 3/7)
  • secrezione ormonale/peptidica (ELISA)
  • attivazione di vie di trasduzione del segnale (AlphaScreen)
  • saggi di attività luciferasica

 

D) STUDI DI CORRELAZIONE GENOTIPO-FENOTIPO

 

E) LETTURA DI PIASTRE IN MULTI MODALITA’

Intensità di fluorescenza, luminescenza, assorbanza (UV, VIS), tecnologia AlphaScreen

 

F) LETTURA DI PIASTRE ALLESTISTE CON VARIE TECNOLOGIE IN STRUMENTI PER REAL-TIME PCR

  • Coloranti intercalanti
  • Sonde TaqMan
  • Discriminazione allelica
  • HRM

 

Su richiesta i servizi offerti possono essere modificati in base alle esigenze del singolo utente che vi accede.

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